蛋白质 – 配体配合的荧光检测:phosphodiesterase5的情况下

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摘要

磷酸二酯酶(PDE)调节cAMP和cGMP的细胞内水平。的PDE5抑制剂的巨大临床成功,西地那非(伟哥),…

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蛋白质 - 配体配合的荧光检测:phosphodiesterase5的情况下

亮点

PDE5-正在成为癌症治疗中有希望的药物靶标

基于FRET-A的方法已被开发,以检测小配体与PDE5的催化位点的结合。

所述的方法,是基于一个新synthetized基底样化合物的位移。

•[123 ]该荧光法可代替目前使用的不安全和费力的放射性PDE5抑制测定。

这种新方法具有适于96孔板形式的可能性。

摘要

磷酸二酯酶(PDE)调节cAMP和cGMP的细胞内水平。的PDE5抑制剂的巨大临床成功,西地那非(伟哥),伐地那非(艾力达)和他达拉非(西力士)导致的增量放宽对这类酶的兴趣。最近的研究显示肿瘤生长和PDE5表达之间的相关性,使得PDE5选择性抑制剂有希望的癌症治疗的候选者。这种抑制剂的研究今天落在放射性检测。在这项工作中,我们利用酶的保守催化结构域,并提出检测配体的结合更快,更安全的方法,并评估他们的亲和力。新方法利用之间的共振能量转移(FRET)的,作为供体,荧光素样diarsenical探头能够共价结合融合到重组PDE5催化结构域和四半胱氨酸基序,作为受体,罗丹明探针共价结合对假底的cGMP。的FRET效率降低当竞争性配体结合的PDE5的催化位点和置换的cGMP罗丹明缀合物。我们已经在结构上所研究的PDE5 /的cGMP-罗丹明复杂通过分子建模和使用了FRET信号定量地表征其结合平衡。竞争位移实验用他达那非和的cGMP进行。竞争位移均衡模型的适配,产生亲和力分别进入配体,纳米和微摩尔,的PDE5

图形抽象

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缩写

PDE5Phosphodiesterase 5PDE5CPhosphodiesterase 5催化domainPDE5C-TCphosphodiesterase 5催化结构域修饰用四吨agPDE5C-TC-FlAsHcomplex获得由闪光灯荧光团缀合到磷酸二酯酶具有tetracystein tagFlAsH-EDT24\'5\'双(1,3,2- dithiarsolan -2-基)-fluoresceincGMPS2\'修饰的5催化域 - (6- Aminohexylcarbamoyl )鸟苷-3\',5\'-环monophosphorothioate

关键词

磷酸二酯酶5Fluorometric配体结合detectionCompetitive位移analysiscGMPS-rhodamineFörster共振能量转移(FRET)亲和常数(Kd)查看全文

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